 © duniabioteknologi™ 2011  Dunia Bioteknologi: Methods

Methods

Dalam menjalankan eksperimen-eksperimen bioteknologi, terdapat pelbagai teknik yang dijalankan bersesuaian dengan tujuan eksperimen. Teknik-teknik tersebut bukan hanya diguna di Malaysia, malah turut diguna di seluruh makmal yang menjalankan eksperimen bioteknologi. Antaranya ialah pemprofilan DNA (DNA Profiling), electroporasi gel (Gel Electroporation), Polymerase Chain Reaction (PCR), DNA recombinant dan sebagainya. Penerangan lanjut adalah seperti di bawah.


Teknik 1: DNA Profiling/DNA Fingerprinting (Pemprofilan DNA)

'DNA Profiling'  adalah teknik yang digunakan oleh ahli sains forensik untuk membantu sama ada dalam penyiasatan, atau pun dalam kerja mengenalpasti individu-individu tertentu berdasarkan profil DNA tertentu. Teknik ini juga biasanya dikenali sebagai 'DNA Fingerprinting', atau 'DNA Testing', atau 'DNA Typing', atau 'genetic fingerprinting'. Sepertimana yang kita sedia maklum, setiap orang mempunyai profil DNA yang unik, dan teknik pemprofilan DNA ini akan digunakan untuk menentukan bahawa set DNA yang mahu dikenal pasti tersebut dimiliki oleh individu tertentu. Kebiasaannya, teknik ini digunakan untuk memastikan hubungan anak dan ibubapa (parental testing), ataupun dalam penyiasatan jenayah.

Teknik ini telah ditemui oleh Sir Alec Jeffreys pada tahun 1985. Dalam dunia forensik, teknik ini merupakan satu teknik yang sangat menarik kerana ianya tidak memerlukan cap jari milik seseorang individu itu, kerana ianya (merujuk DNA) boleh di dapati di mana-mana bahagian sel yang lain, dan setiap individu mempunya set DNA yang unik, termasuklah di mana-mana bahagian sel, dari rambut hinggalah ke kaki. Contoh yang biasa digunakan ialah analisis DNA di sel rambut, ataupun titisan darah di tempat kejadian. Sesungguhnya teknik ini adalah sangat luar biasa kerana sangat membantu dalam pencegahan jenayah, kerana penjenayah sangat sukar untuk tidak meninggalkan kesan 100% dalam tindakan jenayahnya.



Picture: This is how DNA Profiling looks like
Source: http://static.howstuffworks.com/gif/dna-profiling-1.jpg

Walaubagaimanapun, teknik ini masih mempunyai kelemahan, dimana setiap sel yang dijumpai, walaupun ianya unik, namun masih tidak ada 100% kepastian tentang pemilik sel itu yang sebenar. Namun, setidak-tidaknya, teknik ini memberikan kemungkinan tentang pemilik sel itu. Selain itu, teknik ini juga masih mendapat tentangan daripada beberapa pihak, iaitu isu yang berkaitan pengumpulan bank DNA, yang berkemungkinan tidak sah disisi undang-undang negara. Namun setakat ini, kelebihan teknik ini masih lagi mengatasi kekurangannya, dan oleh sebab itu ianya masih logik untuk diaplikasikan.

Sebagai contoh dalam bidang bioteknologi, teknik ini digunakan untuk mengelakkan pembiak-bakaan (inbreeding). Dalam teknik ini, saintis akan memastikan proses mengawan berlaku antara individu yang tidak berkaitan secara genetik (melalui peningkatan dalam 'gene pool', mengurangkan perubahan ekspresi gen perosak atau yang membawa maut, 'deleterious/lethal genes'). Dengan mengenal pasti profil DNA, haiwan ternakan dewasa yang paling berjaya boleh dikenal pasti, dimana keturunan mereka akan mempunyai petanda DNA tersebut. Jadi, ahli saintis akan mengutamakan burung ini untuk membiakkan lagi spesis dalam jumlah yang besar.


Gambar-gambar berikut menerangkan bagaimana teknik ini dilaksanakan:

Source:http://www.dna-sequencing-service.com/wp-content/uploads/2011/04/dna-fingerprinting.gif


Sumber:
http://www.wisegeek.com/what-is-dna-fingerprinting.htm
http://en.wikipedia.org/wiki/DNA_profiling

Video di bawah adalah untuk memberikan gambaran yang lebih jelas tentang teknik 'DNA Profiling' (atau 'DNA Fingerprinting').

i) Versi animasi flash:

1 - http://library.thinkquest.org/C0125833/english/fingerprint_steps.php

ii) Versi video animasi:


iii) Versi sebenar:


Untuk maklumat tambahan, sila layari laman web ini, dimana ia menyampaikan maklumat tentang kaitan antaran teknik 1, 2 dan 3. Juga, anda boleh mendapatkan maklumat mengenai bagaimana ingin melakukan teknik pemprofilan DNA (how to create DNA profile?) di laman web ini, atau laman web ini.



Teknik 2: Elektroporasi Gel (Gel Electrophoresis)
 

Pada awal pengenalan teknik memanipulasi DNA, keratan/potongan DNA dipisahkan di makmal oleh graviti. Pada tahun 1970-an, alat yang berkuasa elektroforesis gel DNA telah dibangunkan. Proses ini menggunakan elektrik untuk menghasilkan keratan/potongan DNA yang berasingan mengikut saiz dan cas seperti yang dihasilkan melalui gel matriks (agar) dan dibezakan mengikut jarak keratan/potongan DNA, iaitu merupakan satu teknik yang dipanggil 'gel elektroforesis'.

Gel diletakkan di dalam bekas elektroforesis, yang kemudiannya disambungkan ke punca kuasa. Apabila arus elektrik digunakan, molekul yang lebih besar bergerak dengan lebih perlahan-lahan melalui gel manakala molekul yang lebih kecil bergerak lebih pantas. Molekul mempunyai saiz yang berbeza, seterusnya membentuk kumpulan-kumpulan yang berbeza gel.




Istilah "gel" dalam contoh ini merujuk kepada matriks digunakan untuk mengandungi, kemudian memisahkan molekul sasaran. Dalam kebanyakan kes, gel polimer crosslinked yang komposisi dan keliangan dipilih berdasarkan berat tertentu dan komposisi sasaran untuk dianalisis. Apabila memisahkan kecil protein atau asid nukleik (DNA, RNA, atau oligonucleotides) gel biasanya terdiri daripada kepekatan yang berbeza acrylamide dan rentas pemaut, menghasilkan rangkaian jejaring yang berbeza bersaiz polyacrylamide.

"Elektroforesis" merujuk kepada daya elektromotif (EMF) yang digunakan untuk menggerakkan molekul melalui matriks gel. Dengan meletakkan molekul di telaga dalam gel dan menggunakan medan elektrik, molekul akan bergerak melalui matriks pada kadar yang berbeza, yang ditentukan sebahagian besarnya oleh massa mereka apabila caj kepada nisbah jisim (Z) spesis semua seragam, ke arah anod jika bercas negatif atau ke arah katod jika bercas positif.




Picture: Gel electrophoresis: 6 "DNA-tracks". In the first row (left), DNA with known fragment sizes was used as a reference. Different bands indicate different fragment sizes.
Source: http://en.wikipedia.org/wiki/File:Gel_electrophoresis_2.jpg

Sumber:
http://www.dnalc.org/resources/animations/gelelectrophoresis.html
http://en.wikipedia.org/wiki/Gel_electrophoresis

http://biology.kenyon.edu/courses/biol114/Chap08/Chapter_08a.html


Lihat media (video, flash animation) di bawah bagi mendapatkan gambaran yang lebih jelas tentang elektroporasi gel.

i) Versi Animasi Flash:

1 - http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/gel/
2 - http://www.dnalc.org/resources/animations/gelelectrophoresis.html

ii) Versi Sebenar:



iii) Versi video Animasi:





iv) Image & Compare DNA Simulation:




Teknik 3: Polymerase Chain Reaction (PCR)

Tindak balas polymerase berangkai (PCR) merupakan satu teknik saintifik dalam biologi molekul untuk menambah bilangan satu atau beberapa salinan DNA mengikut beberapa magnitud tertentu, untuk menjana beribu-ribu kepada berjuta-juta salinan daripada urutan DNA tertentu.



Teknik ini telah dibangunkan pada tahun 1983 oleh Kary Mullis, dan kini, PCR telah menjadi satu teknik yang biasa dan akan digunakan dalam makmal penyelidikan perubatan dan biologi untuk pelbagai aplikasi. Ini termasuk pengklonan DNA (DNA cloning), phylogeny berasaskan DNA, atau analisis fungsi gen; diagnosis penyakit keturunan; mengenal pasti cap jari genetik (digunakan dalam sains forensik dan ujian paterniti); dan pengesanan dan diagnosis penyakit berjangkit. 

Kaedah ini bergantung kepada kitaran thermal (thermal cycling), yang terdiri daripada kitaran pemanasan berulang-ulang, dan penyejukan tindak balas untuk meleburkan DNA dan replikasi enzim DNA. Primers (serpihan DNA pendek) yang mengandungi urutan pelengkap kepada kawasan sasaran bersama-sama dengan enzim polimerase DNA adalah komponen utama bagi membolehkan proses pemilihan, dan ianya berlaku secara berulang-ulang. Ketika PCR sedang berlaku, DNA yang dihasilkan sendiri akan digunakan sebagai template untuk replikasi, dalam proses tindak balas berangkai, di mana template DNA eksponen dikuatkan. Teknik PCR boleh diubahsuai untuk melaksanakan pelbagai manipulasi genetik.


Hampir semua aplikasi PCR menggunakan enzim DNA polimerase yang mempunyai haba stabil, seperti polimerase Taq (Taq polymerase), enzim yang pada berasal daripada bakteria aquaticus Thermus. Polimerase DNA mengumpulkan DNA yang baru daripada blok DNA yang asal, nukleotida (nucleotide), dengan menggunakan DNA yang hanya mempunyai satu lembar (strand) sebagai template oligonucleotide (juga dipanggil primers DNA), yang diperlukan untuk permulaan penghasilan DNA. Majoriti kaedah PCR menggunakan teknik kitaran haba (thermal cycling), iaitu, sebagai gantian pemanasan dan penyejukan sampel PCR kepada suhu-suhu tertentu secara bersiri. 



 
Picture: Prismatic Pool, Yellowstone



Sumber: 


http://www.dnalc.org/resources/animations/pcr.html

http://en.wikipedia.org/wiki/Polymerase_chain_reaction

 

Picture: Photo of a strip of PCR tubes, each tube contains a 100ul reaction.
Source: http://en.wikipedia.org/wiki/File:PCR_tubes.png


Lihat media (video, flash animation) di bawah bagi mendapatkan gambaran yang lebih jelas tentang teknik tindak balas polimerase berangkai (Polymerase Chain Reaction, PCR).



i) Versi animasi flash:
1 - http://www.dnalc.org/resources/animations/pcr.html
2 - http://www.sumanasinc.com/webcontent/animations/content/pcr.html

ii) Versi video animasi:






iii) Versi video sebenar:







Teknik 4: Replikasi DNA  (DNA Replication)

Teknik replikasi DNA adalah satu proses biologi yang berlaku dalam semua organisma hidup dan proses penyalinan DNA ini adalah asas bagi penerusan penghasilannya. Proses ini bermula dengan satu daripada dua lembar (one double-stranded) molekul DNA dan seterusnya menghasilkan dua salinan molekul yang serupa. Setiap untaian molekul DNA yang menjadi dua lembar yang asal (original double-stranded DNA) bertindak sebagai templat untuk penghasilan sepasang lembar yang lengkap (complementary strand).

Di dalam sel, proses replikasi DNA bermula di lokasi tertentu dalam genom, iaitu dipanggil "origin" (asal). Pembukaan lembar (strand) DNA pada tempat "asal", seterusnya penghasilan lembar baru, akan menghasilkan produk replikasi. Di samping itu, enzim DNA polimerase, iaitu sejenis enzim yang menghasilkan DNA baru dengan menambah nukleotida, dan dipadankan dengan satu lembar (strand) templat. Ianya seterusnya menghasilkan beberapa protein lain yang berkaitan dengan produk replikasi, dan membantu dalam permulaan dan penerusan penghasilan DNA.

Replikasi DNA juga boleh dilakukan secara in vitro (buatan, di luar sel). Enzim DNA Polimerase, diasingkan dari sel, dan primers DNA buatan yang digunakan untuk memulakan penghasilan DNA di urutan yang dikenali dalam molekul templat. Reaksi polymerase chain (PCR),  menggunakan apa-apa teknik penghasilan secara bukan semula jadi (artificial) melaui kitaran yang teratur untuk menguatkan sasaran keratan DNA yang spesifik dari kolam DNA (DNA pool).

Picture: Stylized DNA replication fork with nucleotides matched, 5'->3' synthesis shown, no enzymes in diagram.
Source: http://en.wikipedia.org/wiki/File:DNA_replication_split.svg


Lihat media (video, flash animation) di bawah bagi mendapatkan gambaran yang lebih jelas tentang teknik tindak balas polimerase berangkai (Polymerase Chain Reaction, PCR).



i) versi animasi flash:
http://www.mcb.harvard.edu/losick/images/trombonefinald.swf
http://www.johnkyrk.com/DNAreplication.html
http://www.wiley.com/college/pratt/0471393878/student/animations/dna_replication/index.html

ii) versi video animasi: 






iii) versi sebenar:




Teknik-teknik lain

Selain daripada teknik-teknik yang diatas, juga terdapat pelbagai teknik lain yang digunakan dalam makmal bioteknologi, termasuk di Malaysia. Teknik-teknik berikut di ringkaskan, dan disampaikan dalam bahasa inggeris.

1) Cloning genes
In nature, DNA molecules recombine for various functions -- even DNA between different species.  But twenty years ago, despite the work of Barbara McClintock and others, the extent of this recombination was not appreciated.  DNA was still thought to be the "master molecule," not to be violated by "unnatural" manipulation.  When scientists began to manipulate DNA in the test tube,  many scientists feared that disastrous monsters would result, with unspecified dangers to people.  In 1977 scientists at the Asilomar Conference proposed sweeping regulation on so-called "recombinant DNA," technologies which recombine DNA from different species in the test tube.
Since then, the dangers have appeared to be little  more than those of "natural" genetic mixing.  But we remain concerned about issues such as:
  • Engineering food crops to resist pesticides.  The pesticide resistance genes can escape into natural populations of weeds. 
  • Engineering a human symbiont microbe, such as E. coli, to produce a deadly toxin such as botulin.  In theory this could be done, although it's not clear where such an organism would live, or how well it could "compete" with natural flora. 
  • Societal dilemmas of human cloning.  How far shall we use reproductive technology to shape future humans? 
Techniques of Recombinant DNA
How do we manipulate these natural processes for biotechnology; for instance, to make a bacterium that produces large quantities of insulin?
One approach would be to cut the appropriate gene from human DNA and paste, or splice, it into a vector such as a plasmid or phage DNA.  Our "scissors" are the class of enzymes called restriction endonucleases

Restriction Endonucleases
An "endonuclease" is an enzyme that cuts duplex DNA in the middle, not at an end (for exonuclease).   Different species of bacteria have evolved different restriction endonucleases, each to cut foreign DNA that gets into their cells by mistake.  To be cut, the DNA has to lack their own pattern of protective methylation.   There are well over a hundred restriction enzymes, each cutting in a very precise way a specific base sequence of the DNA molecule.

A restriction endonuclease cuts DNA only at a specific site, usually containing 4-6 base pairs.  The enzyme has to cut the DNA backbone twice, recognizing the same type of site; therefore, the site "reads" the same way backwards as forwards--a palindrome.




This "sticky ends" from two different DNA molecules can hybridize together; then the nicks are sealed using ligase.  (Where does ligase come from?  What is its natural function?) The result is recombinant DNA.  When this recombinant vector is inserted into E. coli, the cell will be able to process the instructions to assemble the amino acids for insulin production. More importantly, the new instructions are passed along to the next generation of E. coli cells in the process known as gene cloning.
 




Restriction site Analysis
How can we use restriction sites to analyze the plasmid products of ligation, and tell whether we in fact have ligated the correct molecule:
Problem: Suggest several "incorrect" ways the plasmid could recombine.
More Problems:
Use the PLASMID Program.  You MUST practice restriction analysis with this program; it will be on the quiz and/or the test.

How do we get the recombinant molecule into a bacterial cell?  Usually by transformation (for a plasmid) or by in vitro packaging into a phage head coat (for a phage vector such as lambda phage).
 





The above is a highly simplified description of  recombinant DNA technology.
How would we actually locate the appropriately cloned gene?  There are many different ways, depending on the specific case.  Here is one example, in which a partial sequence of the protein enables us to reverse the code and determine an approximate DNA sequence to use for a radiolabeled probe.  The DNA probe will hybridize to clones containing the correct DNA, even if it is just one piece cut out of an entire genome.



Griffiths et al, W. H. Freeman & Co., current edition


The radioactive probe is made by determining a short segment of the protein sequence, then "back translating" to the possible DNA sequences.  Short DNA sequences are synthesized to match the  protein sequence.  Then these DNA oligomers (known as "oligos") are radiolabeled, and applied to the blotted clones.  They should hybridize only to clones containing sequence encoding the desired protein.

Reverse transcription: cDNA Cloning
Suppose we need to clone a gene containing lots of introns.  What will happen when the bacterium tries to express it?
To overcome this problem, we can start with mRNA isolated  from tissues that produce the desired protein.  We then use reverse transcriptase enzyme (produced by a retrovirus related to HIV) to reverse transcribe the mRNA into a DNA molecule that now is free of introns.  Now we can ligate "sticky ends" onto the cDNA and recombine it into a phage or plasmid vector.
Problem:  Know the differences between genomic cloning and cDNA cloning.
Explain the relative ADVANTAGES and DISADVANTAGES of each technique--depending on the aim of your research.
 

2) Transgenic
i)Cloning in Animals. 
Animals have two different classes of cells: germ line and somatic. Only alterations in the germ cells can be transmitted to future generations.  However, some forms of somatic cell gene therapy can be useful in treating patients.  For example, people with cystic fibrosis can receive the cloned CFTR gene in a nasal spray, which then infects the lining of their lungs and improves lung function.  The infected (transformed) epithelial cells eventually are lost, however, during normal processes of tissue growth, so the treatment needs to be repeated. Germ-line cloning.  There are two basic ways to clone a gene in the mammalian germ line.
  • Inject a DNA fragment containing your gene into the nucleus of a fertilized egg (germ-line gene cloning) or of body tissues in a mature host (somatic gene cloning).  The DNA gets taken up at random somewhere in one of the chromosomes. 
  • An example of germ-line cloning is the injection of angiopoietin cDNA into the fertilized mouse egg. (An example of somatic cloning is gene therapy for cystic fibrosis: inhale a vector containing the CF gene, which gets incorporated into the DNA of cells lining the lungs.  Somatic cloned genes are not inherited by offspring.)  
  • Put a transgene containing positive and negative selective markers into an embryonic stem cell tissue culture.  The ES cells take up the gene by homologous recombination, replacing the host allele.  The ES cells now are injected into a blastula of an unrelated host, and some of the next generation progeny arise from the ES cells.  To learn more about this, read Capecchi's article on Targeted Transgenes, on reserve. 
Once you have cloned a valuable gene into an animal, say a sheep that makes insulin in its milk, how can we produce lots of identical progeny quickly without sexual reproduction?   This is what the popular press calls "cloning."   (More after spring break.) But when you create a clone, how do you know it worked?  You need to know:
  • DNA: Did the transgene really incorporate into the genome?  Where? 
  • RNA: Is the RNA expressed?  (Or prevented from expression, by a null allele?) 
  • Protein: Is a desired protein expressed? 
ii)Cloning in Plants. 
Plants don't have separate somatic and germ cells, so creating transgenic plants is easier than creating transgenic animals. Techniques include the use of microprojectile bombardment (the "gene gun") and the use of Agrobacterium tumefaciens.

For other techniques (Gene Sequence Analysis, Hybridization and DNA Microarrays), please click here.




Source: 
http://biology.kenyon.edu/courses/biol114/Chap08/Chapter_08a.html
back to top