Dalam menjalankan eksperimen-eksperimen bioteknologi, terdapat pelbagai teknik yang dijalankan bersesuaian dengan tujuan eksperimen. Teknik-teknik tersebut bukan hanya diguna di Malaysia, malah turut diguna di seluruh makmal yang menjalankan eksperimen bioteknologi. Antaranya ialah pemprofilan DNA (DNA Profiling), electroporasi gel (Gel Electroporation), Polymerase Chain Reaction (PCR), DNA recombinant dan sebagainya. Penerangan lanjut adalah seperti di bawah.
Teknik 1: DNA Profiling/DNA Fingerprinting (Pemprofilan DNA)
'DNA Profiling' adalah teknik yang digunakan oleh ahli sains forensik untuk membantu sama ada dalam penyiasatan, atau pun dalam kerja mengenalpasti individu-individu tertentu berdasarkan profil DNA tertentu. Teknik ini juga biasanya dikenali sebagai 'DNA Fingerprinting', atau 'DNA Testing', atau 'DNA Typing', atau 'genetic fingerprinting'. Sepertimana yang kita sedia maklum, setiap orang mempunyai profil DNA yang unik, dan teknik pemprofilan DNA ini akan digunakan untuk menentukan bahawa set DNA yang mahu dikenal pasti tersebut dimiliki oleh individu tertentu. Kebiasaannya, teknik ini digunakan untuk memastikan hubungan anak dan ibubapa (parental testing), ataupun dalam penyiasatan jenayah.
Teknik ini telah ditemui oleh Sir Alec Jeffreys pada tahun 1985. Dalam dunia forensik, teknik ini merupakan satu teknik yang sangat menarik kerana ianya tidak memerlukan cap jari milik seseorang individu itu, kerana ianya (merujuk DNA) boleh di dapati di mana-mana bahagian sel yang lain, dan setiap individu mempunya set DNA yang unik, termasuklah di mana-mana bahagian sel, dari rambut hinggalah ke kaki. Contoh yang biasa digunakan ialah analisis DNA di sel rambut, ataupun titisan darah di tempat kejadian. Sesungguhnya teknik ini adalah sangat luar biasa kerana sangat membantu dalam pencegahan jenayah, kerana penjenayah sangat sukar untuk tidak meninggalkan kesan 100% dalam tindakan jenayahnya.
Walaubagaimanapun, teknik ini masih mempunyai kelemahan, dimana setiap sel yang dijumpai, walaupun ianya unik, namun masih tidak ada 100% kepastian tentang pemilik sel itu yang sebenar. Namun, setidak-tidaknya, teknik ini memberikan kemungkinan tentang pemilik sel itu. Selain itu, teknik ini juga masih mendapat tentangan daripada beberapa pihak, iaitu isu yang berkaitan pengumpulan bank DNA, yang berkemungkinan tidak sah disisi undang-undang negara. Namun setakat ini, kelebihan teknik ini masih lagi mengatasi kekurangannya, dan oleh sebab itu ianya masih logik untuk diaplikasikan.
Sebagai contoh dalam bidang bioteknologi, teknik ini digunakan untuk mengelakkan pembiak-bakaan (inbreeding). Dalam teknik ini, saintis akan memastikan proses mengawan berlaku antara individu yang tidak berkaitan secara genetik (melalui peningkatan dalam 'gene pool', mengurangkan perubahan ekspresi gen perosak atau yang membawa maut, 'deleterious/lethal genes'). Dengan mengenal pasti profil DNA, haiwan ternakan dewasa yang paling berjaya boleh dikenal pasti, dimana keturunan mereka akan mempunyai petanda DNA tersebut. Jadi, ahli saintis akan mengutamakan burung ini untuk membiakkan lagi spesis dalam jumlah yang besar.
Teknik 1: DNA Profiling/DNA Fingerprinting (Pemprofilan DNA)
'DNA Profiling' adalah teknik yang digunakan oleh ahli sains forensik untuk membantu sama ada dalam penyiasatan, atau pun dalam kerja mengenalpasti individu-individu tertentu berdasarkan profil DNA tertentu. Teknik ini juga biasanya dikenali sebagai 'DNA Fingerprinting', atau 'DNA Testing', atau 'DNA Typing', atau 'genetic fingerprinting'. Sepertimana yang kita sedia maklum, setiap orang mempunyai profil DNA yang unik, dan teknik pemprofilan DNA ini akan digunakan untuk menentukan bahawa set DNA yang mahu dikenal pasti tersebut dimiliki oleh individu tertentu. Kebiasaannya, teknik ini digunakan untuk memastikan hubungan anak dan ibubapa (parental testing), ataupun dalam penyiasatan jenayah.
Teknik ini telah ditemui oleh Sir Alec Jeffreys pada tahun 1985. Dalam dunia forensik, teknik ini merupakan satu teknik yang sangat menarik kerana ianya tidak memerlukan cap jari milik seseorang individu itu, kerana ianya (merujuk DNA) boleh di dapati di mana-mana bahagian sel yang lain, dan setiap individu mempunya set DNA yang unik, termasuklah di mana-mana bahagian sel, dari rambut hinggalah ke kaki. Contoh yang biasa digunakan ialah analisis DNA di sel rambut, ataupun titisan darah di tempat kejadian. Sesungguhnya teknik ini adalah sangat luar biasa kerana sangat membantu dalam pencegahan jenayah, kerana penjenayah sangat sukar untuk tidak meninggalkan kesan 100% dalam tindakan jenayahnya.
Walaubagaimanapun, teknik ini masih mempunyai kelemahan, dimana setiap sel yang dijumpai, walaupun ianya unik, namun masih tidak ada 100% kepastian tentang pemilik sel itu yang sebenar. Namun, setidak-tidaknya, teknik ini memberikan kemungkinan tentang pemilik sel itu. Selain itu, teknik ini juga masih mendapat tentangan daripada beberapa pihak, iaitu isu yang berkaitan pengumpulan bank DNA, yang berkemungkinan tidak sah disisi undang-undang negara. Namun setakat ini, kelebihan teknik ini masih lagi mengatasi kekurangannya, dan oleh sebab itu ianya masih logik untuk diaplikasikan.
Sebagai contoh dalam bidang bioteknologi, teknik ini digunakan untuk mengelakkan pembiak-bakaan (inbreeding). Dalam teknik ini, saintis akan memastikan proses mengawan berlaku antara individu yang tidak berkaitan secara genetik (melalui peningkatan dalam 'gene pool', mengurangkan perubahan ekspresi gen perosak atau yang membawa maut, 'deleterious/lethal genes'). Dengan mengenal pasti profil DNA, haiwan ternakan dewasa yang paling berjaya boleh dikenal pasti, dimana keturunan mereka akan mempunyai petanda DNA tersebut. Jadi, ahli saintis akan mengutamakan burung ini untuk membiakkan lagi spesis dalam jumlah yang besar.
Sumber artikel : wisegeek, wikipedia
Teknik 2: Elektroporasi Gel (Gel Electrophoresis)
Pada awal pengenalan teknik memanipulasi DNA, keratan/potongan DNA dipisahkan di makmal oleh graviti. Pada tahun 1970-an, alat yang berkuasa elektroforesis gel DNA telah dibangunkan. Proses ini menggunakan elektrik untuk menghasilkan keratan/potongan DNA yang berasingan mengikut saiz dan cas seperti yang dihasilkan melalui gel matriks (agar) dan dibezakan mengikut jarak keratan/potongan DNA, iaitu merupakan satu teknik yang dipanggil 'gel elektroforesis'.
Gel diletakkan di dalam bekas elektroforesis, yang kemudiannya disambungkan ke punca kuasa. Apabila arus elektrik digunakan, molekul yang lebih besar bergerak dengan lebih perlahan-lahan melalui gel manakala molekul yang lebih kecil bergerak lebih pantas. Molekul mempunyai saiz yang berbeza, seterusnya membentuk kumpulan-kumpulan yang berbeza gel.
Istilah "gel" dalam contoh ini merujuk kepada matriks digunakan untuk mengandungi, kemudian memisahkan molekul sasaran. Dalam kebanyakan kes, gel polimer crosslinked yang komposisi dan keliangan dipilih berdasarkan berat tertentu dan komposisi sasaran untuk dianalisis. Apabila memisahkan kecil protein atau asid nukleik (DNA, RNA, atau oligonucleotides) gel biasanya terdiri daripada kepekatan yang berbeza acrylamide dan rentas pemaut, menghasilkan rangkaian jejaring yang berbeza bersaiz polyacrylamide.
"Elektroforesis" merujuk kepada daya elektromotif (EMF) yang digunakan untuk menggerakkan molekul melalui matriks gel. Dengan meletakkan molekul di telaga dalam gel dan menggunakan medan elektrik, molekul akan bergerak melalui matriks pada kadar yang berbeza, yang ditentukan sebahagian besarnya oleh massa mereka apabila caj kepada nisbah jisim (Z) spesis semua seragam, ke arah anod jika bercas negatif atau ke arah katod jika bercas positif.
Sumber artikel : dnalc, wikepedia, kenyon.edu
Teknik 3: Polymerase Chain Reaction (PCR)
Tindak balas polymerase berangkai (PCR) merupakan satu teknik saintifik dalam biologi molekul untuk menambah bilangan satu atau beberapa salinan DNA mengikut beberapa magnitud tertentu, untuk menjana beribu-ribu kepada berjuta-juta salinan daripada urutan DNA tertentu.
Teknik ini telah dibangunkan pada tahun 1983 oleh Kary Mullis, dan kini, PCR telah menjadi satu teknik yang biasa dan akan digunakan dalam makmal penyelidikan perubatan dan biologi untuk pelbagai aplikasi. Ini termasuk pengklonan DNA (DNA cloning), phylogeny berasaskan DNA, atau analisis fungsi gen; diagnosis penyakit keturunan; mengenal pasti cap jari genetik (digunakan dalam sains forensik dan ujian paterniti); dan pengesanan dan diagnosis penyakit berjangkit.
Kaedah ini bergantung kepada kitaran thermal (thermal cycling), yang terdiri daripada kitaran pemanasan berulang-ulang, dan penyejukan tindak balas untuk meleburkan DNA dan replikasi enzim DNA. Primers (serpihan DNA pendek) yang mengandungi urutan pelengkap kepada kawasan sasaran bersama-sama dengan enzim polimerase DNA adalah komponen utama bagi membolehkan proses pemilihan, dan ianya berlaku secara berulang-ulang. Ketika PCR sedang berlaku, DNA yang dihasilkan sendiri akan digunakan sebagai template untuk replikasi, dalam proses tindak balas berangkai, di mana template DNA eksponen dikuatkan. Teknik PCR boleh diubahsuai untuk melaksanakan pelbagai manipulasi genetik.
Hampir semua aplikasi PCR menggunakan enzim DNA polimerase yang mempunyai haba stabil, seperti polimerase Taq (Taq polymerase), enzim yang pada berasal daripada bakteria aquaticus Thermus. Polimerase DNA mengumpulkan DNA yang baru daripada blok DNA yang asal, nukleotida (nucleotide), dengan menggunakan DNA yang hanya mempunyai satu lembar (strand) sebagai template oligonucleotide (juga dipanggil primers DNA), yang diperlukan untuk permulaan penghasilan DNA. Majoriti kaedah PCR menggunakan teknik kitaran haba (thermal cycling), iaitu, sebagai gantian pemanasan dan penyejukan sampel PCR kepada suhu-suhu tertentu secara bersiri.
Teknik 2: Elektroporasi Gel (Gel Electrophoresis)
Pada awal pengenalan teknik memanipulasi DNA, keratan/potongan DNA dipisahkan di makmal oleh graviti. Pada tahun 1970-an, alat yang berkuasa elektroforesis gel DNA telah dibangunkan. Proses ini menggunakan elektrik untuk menghasilkan keratan/potongan DNA yang berasingan mengikut saiz dan cas seperti yang dihasilkan melalui gel matriks (agar) dan dibezakan mengikut jarak keratan/potongan DNA, iaitu merupakan satu teknik yang dipanggil 'gel elektroforesis'.
Gel diletakkan di dalam bekas elektroforesis, yang kemudiannya disambungkan ke punca kuasa. Apabila arus elektrik digunakan, molekul yang lebih besar bergerak dengan lebih perlahan-lahan melalui gel manakala molekul yang lebih kecil bergerak lebih pantas. Molekul mempunyai saiz yang berbeza, seterusnya membentuk kumpulan-kumpulan yang berbeza gel.
"Elektroforesis" merujuk kepada daya elektromotif (EMF) yang digunakan untuk menggerakkan molekul melalui matriks gel. Dengan meletakkan molekul di telaga dalam gel dan menggunakan medan elektrik, molekul akan bergerak melalui matriks pada kadar yang berbeza, yang ditentukan sebahagian besarnya oleh massa mereka apabila caj kepada nisbah jisim (Z) spesis semua seragam, ke arah anod jika bercas negatif atau ke arah katod jika bercas positif.
Sumber artikel : dnalc, wikepedia, kenyon.edu
Teknik 3: Polymerase Chain Reaction (PCR)
Tindak balas polymerase berangkai (PCR) merupakan satu teknik saintifik dalam biologi molekul untuk menambah bilangan satu atau beberapa salinan DNA mengikut beberapa magnitud tertentu, untuk menjana beribu-ribu kepada berjuta-juta salinan daripada urutan DNA tertentu.
Kaedah ini bergantung kepada kitaran thermal (thermal cycling), yang terdiri daripada kitaran pemanasan berulang-ulang, dan penyejukan tindak balas untuk meleburkan DNA dan replikasi enzim DNA. Primers (serpihan DNA pendek) yang mengandungi urutan pelengkap kepada kawasan sasaran bersama-sama dengan enzim polimerase DNA adalah komponen utama bagi membolehkan proses pemilihan, dan ianya berlaku secara berulang-ulang. Ketika PCR sedang berlaku, DNA yang dihasilkan sendiri akan digunakan sebagai template untuk replikasi, dalam proses tindak balas berangkai, di mana template DNA eksponen dikuatkan. Teknik PCR boleh diubahsuai untuk melaksanakan pelbagai manipulasi genetik.
Hampir semua aplikasi PCR menggunakan enzim DNA polimerase yang mempunyai haba stabil, seperti polimerase Taq (Taq polymerase), enzim yang pada berasal daripada bakteria aquaticus Thermus. Polimerase DNA mengumpulkan DNA yang baru daripada blok DNA yang asal, nukleotida (nucleotide), dengan menggunakan DNA yang hanya mempunyai satu lembar (strand) sebagai template oligonucleotide (juga dipanggil primers DNA), yang diperlukan untuk permulaan penghasilan DNA. Majoriti kaedah PCR menggunakan teknik kitaran haba (thermal cycling), iaitu, sebagai gantian pemanasan dan penyejukan sampel PCR kepada suhu-suhu tertentu secara bersiri.
Sumber artikel : dnalc, wikipedia
Teknik 4: Replikasi DNA (DNA Replication)
Teknik replikasi DNA adalah satu proses biologi yang berlaku dalam semua organisma hidup dan proses penyalinan DNA ini adalah asas bagi penerusan penghasilannya. Proses ini bermula dengan satu daripada dua lembar (one double-stranded) molekul DNA dan seterusnya menghasilkan dua salinan molekul yang serupa. Setiap untaian molekul DNA yang menjadi dua lembar yang asal (original double-stranded DNA) bertindak sebagai templat untuk penghasilan sepasang lembar yang lengkap (complementary strand).
Di dalam sel, proses replikasi DNA bermula di lokasi tertentu dalam genom, iaitu dipanggil "origin" (asal). Pembukaan lembar (strand) DNA pada tempat "asal", seterusnya penghasilan lembar baru, akan menghasilkan produk replikasi. Di samping itu, enzim DNA polimerase, iaitu sejenis enzim yang menghasilkan DNA baru dengan menambah nukleotida, dan dipadankan dengan satu lembar (strand) templat. Ianya seterusnya menghasilkan beberapa protein lain yang berkaitan dengan produk replikasi, dan membantu dalam permulaan dan penerusan penghasilan DNA.
Replikasi DNA juga boleh dilakukan secara in vitro (buatan, di luar sel). Enzim DNA Polimerase, diasingkan dari sel, dan primers DNA buatan yang digunakan untuk memulakan penghasilan DNA di urutan yang dikenali dalam molekul templat. Reaksi polymerase chain (PCR), menggunakan apa-apa teknik penghasilan secara bukan semula jadi (artificial) melaui kitaran yang teratur untuk menguatkan sasaran keratan DNA yang spesifik dari kolam DNA (DNA pool).
Teknik-teknik lain
Teknik 4: Replikasi DNA (DNA Replication)
Teknik replikasi DNA adalah satu proses biologi yang berlaku dalam semua organisma hidup dan proses penyalinan DNA ini adalah asas bagi penerusan penghasilannya. Proses ini bermula dengan satu daripada dua lembar (one double-stranded) molekul DNA dan seterusnya menghasilkan dua salinan molekul yang serupa. Setiap untaian molekul DNA yang menjadi dua lembar yang asal (original double-stranded DNA) bertindak sebagai templat untuk penghasilan sepasang lembar yang lengkap (complementary strand).
Di dalam sel, proses replikasi DNA bermula di lokasi tertentu dalam genom, iaitu dipanggil "origin" (asal). Pembukaan lembar (strand) DNA pada tempat "asal", seterusnya penghasilan lembar baru, akan menghasilkan produk replikasi. Di samping itu, enzim DNA polimerase, iaitu sejenis enzim yang menghasilkan DNA baru dengan menambah nukleotida, dan dipadankan dengan satu lembar (strand) templat. Ianya seterusnya menghasilkan beberapa protein lain yang berkaitan dengan produk replikasi, dan membantu dalam permulaan dan penerusan penghasilan DNA.
Replikasi DNA juga boleh dilakukan secara in vitro (buatan, di luar sel). Enzim DNA Polimerase, diasingkan dari sel, dan primers DNA buatan yang digunakan untuk memulakan penghasilan DNA di urutan yang dikenali dalam molekul templat. Reaksi polymerase chain (PCR), menggunakan apa-apa teknik penghasilan secara bukan semula jadi (artificial) melaui kitaran yang teratur untuk menguatkan sasaran keratan DNA yang spesifik dari kolam DNA (DNA pool).
Teknik-teknik lain
[1] Pengklonan Gen
Dalam alam semula jadi, molekul DNA melakukan rekombinasi untuk pelbagai fungsi - bahkan DNA antara spesies yang berbeza. Namun, dua puluh tahun yang lalu, meskipun dengan hasil kerja Barbara McClintock dan yang lain, skala rekombinasi ini tidak dihargai sepenuhnya. DNA masih dianggap sebagai "molekul utama" yang tidak boleh dimanipulasi dengan cara "tidak semula jadi". Apabila saintis mula memanipulasi DNA dalam tabung uji, ramai saintis bimbang bahawa raksasa yang mengerikan akan terhasil, dengan bahaya yang tidak ditentukan kepada manusia. Pada tahun 1977, saintis di Persidangan Asilomar mencadangkan peraturan yang ketat terhadap teknologi "DNA rekombinan", yang menggabungkan DNA dari spesies berbeza dalam tabung uji.
Sejak itu, bahaya yang dijangka nampaknya tidak lebih daripada bahaya "pencampuran" genetik semula jadi. Namun, kita tetap bimbang tentang isu seperti:
- Kejuruteraan tanaman makanan untuk menahan racun perosak. Gen tahan racun perosak boleh melarikan diri ke populasi rumpai semula jadi.
- Kejuruteraan mikrob simbiotik manusia, seperti E. coli, untuk menghasilkan toksin maut seperti botulin. Secara teori ini boleh dilakukan, walaupun tidak jelas di mana organisma seperti itu akan hidup, atau seberapa baik ia boleh "bersaing" dengan flora semula jadi.
- Dilema sosial pengklonan manusia. Sejauh mana kita harus menggunakan teknologi pembiakan untuk membentuk manusia masa depan?
Teknik DNA Rekombinan
Bagaimana kita memanipulasi proses semula jadi ini untuk bioteknologi; sebagai contoh, untuk membuat bakteria yang menghasilkan insulin dalam jumlah besar? Satu pendekatan adalah dengan memotong gen yang sesuai dari DNA manusia dan melekatkannya, atau menggabungkannya, ke dalam vektor seperti plasmid atau DNA fasa. "Gunting" kita adalah kelas enzim yang disebut endonuklease sekatan.
**Endonuklease Sekatan**
"Endonuklease" adalah enzim yang memotong DNA dupleks di tengah, bukan di hujung (untuk eksinuklease). Spesies bakteria yang berbeza telah mengembangkan endonuklease sekatan yang berbeza, masing-masing untuk memotong DNA asing yang masuk ke dalam sel mereka secara tidak sengaja. Untuk dipotong, DNA mesti kekurangan corak metilasi pelindung mereka sendiri. Terdapat lebih daripada seratus enzim sekatan, masing-masing memotong dengan cara yang sangat tepat pada urutan asas tertentu molekul DNA.
Endonuklease sekatan memotong DNA hanya pada tapak tertentu, biasanya mengandungi 4-6 pasangan asas. Enzim itu perlu memotong tulang belakang DNA dua kali, mengenali jenis tapak yang sama; oleh itu, tapak tersebut "membaca" dengan cara yang sama ke belakang seperti ke hadapan - sebuah palindrom.
"Ujung melekit" ini dari dua molekul DNA yang berbeza boleh hibrid bersama; kemudian celah tersebut ditutup menggunakan ligase. (Dari mana datangnya ligase? Apa fungsi semula jadinya?) Hasilnya adalah DNA rekombinan. Apabila vektor rekombinan ini dimasukkan ke dalam E. coli, sel akan dapat memproses arahan untuk menyusun asid amino untuk pengeluaran insulin. Yang lebih penting, arahan baru ini disampaikan kepada generasi seterusnya sel E. coli dalam proses yang dikenali sebagai pengklonan gen.
Analisis Tapak Sekatan
Bagaimana kita boleh menggunakan tapak sekatan untuk menganalisis produk plasmid dari ligasi, dan mengetahui sama ada kita sebenarnya telah menggabungkan molekul yang betul:
- Masalah: Cadangkan beberapa cara "tidak betul" plasmid boleh menggabungkan.
- Lebih Banyak Masalah: Gunakan Program PLASMID. Anda MESTI berlatih analisis sekatan dengan program ini; ia akan ada dalam kuiz dan/atau ujian.
Bagaimana kita memasukkan molekul rekombinan ke dalam sel bakteria? Biasanya dengan transformasi (untuk plasmid) atau dengan pembungkusan in vitro ke dalam lapisan kepala fasa (untuk vektor fasa seperti lambda fasa).
Di atas adalah penerangan yang sangat dipermudahkan tentang teknologi DNA rekombinan. Bagaimana kita sebenarnya menempatkan gen yang telah diklonkan dengan tepat? Terdapat banyak cara yang berbeza, bergantung kepada kes tertentu. Berikut adalah satu contoh, di mana urutan sebahagian protein membolehkan kita membalikkan kod dan menentukan urutan DNA anggaran untuk digunakan sebagai probe berlabel radioaktif. Probe DNA akan hibrid dengan klon yang mengandungi DNA yang betul, walaupun ia hanya satu keping yang dipotong dari keseluruhan genom.
Probe radioaktif dibuat dengan menentukan segmen pendek urutan protein, kemudian "membalikkan terjemahan" kepada kemungkinan urutan DNA. Urutan pendek DNA disintesis untuk dipadankan dengan urutan protein. Kemudian oligomer DNA ini (dikenali sebagai "oligos") dilabelkan radioaktif, dan digunakan pada klon yang diblot. Mereka sepatutnya hanya hibrid dengan klon yang mengandungi urutan yang mengekod protein yang dikehendaki.
Transkripsi Terbalik: Pengklonan cDNA
Katakan kita perlu mengklonkan gen yang mengandungi banyak intron. Apa yang akan terjadi apabila bakteria cuba mengungkapkannya?
Untuk mengatasi masalah ini, kita boleh memulakan dengan mRNA yang diasingkan dari tisu yang menghasilkan protein yang diinginkan. Kita kemudian menggunakan enzim transkriptase terbalik (dihasilkan oleh retrovirus yang berkaitan dengan HIV) untuk mentranskripsi terbalik mRNA menjadi molekul DNA yang kini bebas dari intron. Sekarang kita boleh melekatkan "ujung melekit" pada cDNA dan menggabungkannya ke dalam vektor fasa atau plasmid.
- Masalah: Ketahui perbezaan antara pengklonan genomik dan pengklonan cDNA. Terangkan KELEBIHAN dan KEKURANGAN relatif setiap teknik - bergantung pada tujuan penyelidikan anda.
[2] Transgenik
i) Pengklonan dalam Haiwan
Haiwan mempunyai dua kelas sel yang berbeza: garis kuman dan somatik. Hanya perubahan dalam sel kuman yang dapat ditularkan kepada generasi akan datang. Namun, beberapa bentuk terapi gen sel somatik boleh berguna dalam merawat pesakit. Sebagai contoh, orang yang menghidap fibrosis kistik boleh menerima gen CFTR yang diklon dalam semburan hidung, yang kemudian menjangkiti lapisan paru-paru mereka dan memperbaiki fungsi paru-paru. Sel epitelium yang dijangkiti (ditransformasi) akhirnya akan hilang, walau bagaimanapun, semasa proses pertumbuhan tisu normal, jadi rawatan perlu diulang.
Pengklonan Garis Kuman
Terdapat dua cara asas untuk mengklon gen dalam garis kuman mamalia:
- Suntikkan fragmen DNA yang mengandungi gen anda ke dalam nukleus telur yang telah disenyawakan (pengklonan gen garis kuman) atau tisu badan dalam hos yang matang (pengklonan gen somatik). DNA diambil secara rawak di suatu tempat dalam salah satu kromosom.
- Contoh pengklonan garis kuman ialah penyuntikan cDNA angiopoietin ke dalam telur tikus yang disenyawakan. (Contoh pengklonan somatik ialah terapi gen untuk fibrosis kistik: menyedut vektor yang mengandungi gen CF, yang dimasukkan ke dalam DNA sel-sel yang melapisi paru-paru. Gen klon somatik tidak diwarisi oleh keturunan.)
- Letakkan transgen yang mengandungi penanda selektif positif dan negatif ke dalam kultur tisu sel batang embrio. Sel-sel ES mengambil gen melalui rekombinasi homolog, menggantikan alel hos. Sel-sel ES kini disuntik ke dalam blastula hos yang tidak berkaitan, dan beberapa keturunan generasi seterusnya timbul dari sel-sel ES. Untuk mempelajari lebih lanjut tentang ini, baca artikel Capecchi mengenai Targeted Transgenes, pada simpanan.
Sebaik sahaja anda telah mengklon gen yang berharga ke dalam haiwan, katakan seekor biri-biri yang menghasilkan insulin dalam susunya, bagaimana kita dapat menghasilkan banyak keturunan yang serupa dengan cepat tanpa pembiakan seksual? Inilah yang disebut oleh media popular sebagai "pengklonan". Tetapi apabila anda mencipta klon, bagaimana anda tahu ia berjaya? Anda perlu tahu:
- DNA: Adakah transgen benar-benar dimasukkan ke dalam genom? Di mana?
- RNA: Adakah RNA diekspresikan? (Atau dicegah daripada diekspresikan, oleh alel null?)
- Protein: Adakah protein yang diinginkan diekspresikan?
ii) Pengklonan dalam Tumbuhan
Tumbuhan tidak mempunyai sel somatik dan kuman yang terpisah, jadi mencipta tumbuhan transgenik lebih mudah daripada mencipta haiwan transgenik. Teknik-teknik ini termasuk penggunaan pembombardiran mikroprojektil (pistol gen) dan penggunaan Agrobacterium tumefaciens.
Sumber artikel : kenyon.edu
